药敏试验根据美国临床标准委员会（NCCLS）推荐的K-B琼脂法进行，药敏纸片选择中国生物制品鉴定所药敏纸片，试验所选择药物必须包括下列抗生素：氨苄西林（AMP），阿莫西林/克拉维酸（AMC），头孢噻吩（CFT），头孢噻肟（CTX），庆大霉素（GEN），萘啶酸（NAL），诺氟沙星（NOR），四环素（TBT），利福平（RFA），复方新喏明（SMZ）。

1 操作方法：

(1)将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。

(2)用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。用棉拭子涂布整个M-H培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。

(3)待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。在菌接种后15分钟内贴完纸片。

(4)将平板反转，孵育18～24小时后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录（附表5）。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。

2 注意事项：

(1)制备MH琼脂平板应用直径90mm平皿，在水平的实验台上倾注。琼脂厚为4±0.5mm（约25-30ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱烤干平皿表面水滴。倾注平皿前应用pH计测pH值是否正确(pH应为7.3)。pH过低会导致氨基糖苷类，大环内酯类失效，而青霉素活力增强。

(2) 药敏纸片长期储存应于－20℃，日常使用的小量纸片可放在4℃，但应至于含干燥剂的密封容器内。使用时从低温取出后,放置平衡到室温后才可打开，用完后应立即将纸片放回冰箱内的密封容器内。 过期纸片不能使用, 应弃去。

(3) 不稳定药物如亚胺培南, 头孢克洛, 克拉维酸复合药等, 应冷冻保存, 最好在-40 ℃以下。

(4) 保证质控菌株不变异的简便方法，将新得到的冻干菌株接种含血的M-H平板复活。然后每株细菌接种10支高层琼脂管，放置冰箱保存。每月取出一支，传出细菌供常规用。待用剩至最后一支，可传种在M-H平板上，再接种一批高层琼脂管备用。如此可保证原始菌种永不接触抗菌素。

3质量控制：

(1)质量控制方法 

是用与常规实验相同的操作方法，测定质控菌株的抑菌环。应使用新鲜传代的菌种。接种菌液的涂布方法等均同常规操作，测定的抗菌素种类也应与常规测定的种类相同。按表2所列的数据测定相应菌株的抑菌环,并记录结果。

(2)质控试验频率

用新一批MH琼脂或新抗生素纸片时做质控。每日试验时, 同时做质控—监测系统整体质量。在每日合格的基础上，可改为每周做。一个药物/细菌组合连续30天的抑菌圈直径结果中, 超出准确质控范围的不多于3个，如符合要求, 每一质控菌株可以每周进行质控而不必每日进行。

(3)失控

一旦发现失控，应从培养基、纸片、接种菌液等方面去查找原因，并及时纠正。无明显错误而出现失控结果时要恢复每天质控, 直至找到错误原因并提出解决办法为止；用合适质控菌株连续测试5天, 所有5个抑菌圈直径都在允许范围内；恢复每周作之前,应有30个试验日有满意结果。